United States Patent 5733553
Анотация:
Рекомбинантна ваксина за контрол на раждаемостта, включваща бета субединицата на хорионгонадотропин, рекомбинантен лутеинизиращ хормон или смес от тях е разработена. Това рекомбинантна ваксина за контрол на раждаемостта може да действа и като ваксина срещу протеин или пептид несвързан с репродуктивната система на бозайници, като протеин или пептид, свързан със заболяване на организма, като хепатит Б.
Изобретателите:
Talwar, Gursaran Prasad (c/o National Institute of Immunology, Shadid Jeet Singh Marg, New Delhi, IN)
Srinivasan, Jay (Dept. of Biology, Washington University Campus, Box No:1137, One Brookings, St. Louis, MO, 63130-4899)
Chakrabarti, Sekhar (c/o The National Institutes of Health, (Room 237, Building 4), Bethesda, MD, 20892)

Application Number:
08/263483

Publication Date:
03/31/1998

Filing Date:
06/21/1994

View Patent Images:
Images are available in PDF form when logged in. To view PDFs, Login or Create Account (Free!)

Export Citation:
Click for automatic bibliography generation

Primary Class:
424/198.100

Other Classes:
424/227.100, 435/69.300, 435/69.100, 424/199.100

International Classes:
C07K14/145; C07K14/59; C12N15/863; C07K14/005; C07K14/435; A61K39/00

Field of Search:
424/198.1, 424/227.1, 424/199.1, 435/69.1, 435/69.3

US Patent References:
4738846Vaccine for vesicular stomatitis virusApril, 1988Rose et al.424/874780312Birth control vaccineOctober, 1988Talwar424/884847080Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipide vesicle carriersJuly, 1989Neurath et al.424/89

Foreign References:
WO/1986/007383December, 1986

Автоантигенни ваксини

Други справки:
Talwar и сътрудници. "Последните развития в имуноконтрацепцията" American Journal по акушерство и гинекология (1987) 157:1075-1078.
Lall и сътр. "Рекомбинантна вирусна ваксинна имунореактивна субединица алфа на овчи лутеинизиращ хормон, който е свързван с beta. чХГ за генериране на биоактивни димер" Индийски вестник по биохимия и биофизика (1988) 25:510-514.
Едуардс, Rg. Забременяване на човешките индивиди, стр. 200-201, 1980, Академична Преса.
Найлс, ED, и др. "ваксинен вирус ген D8 кодира вирионен  трансмембранен протеин" Й. виола. (1988) 62 (10) :3772-3778.
Chakrabarti, С., и др. Експресия на биологично активни човешки хорион гонадотропин и подразделенията чрез рекомбинантна вирусна ваксина" Gene (1989) 77:89-93.
Смит, GL, и др., "ваксинни вирусни рекомбинанти, които експпресират хепатит B вирус повърхностен антиген"  Nature (1983) 302:490-495.
Първичен проверител:
Feisee, Лила

Асистент проверител:
Рийвс, Джули Д.

Прокурор, агент или Фирма:
Morrison & Foerster

Данни за първичния случай:
Това заявление е продължаване на приложеното Ser. № 07/844, 566, подадено на 27 май 1992 г. изоставено.
Твърдения:
Ние твърдим:
1. Нуклеотидната последователност (I) кодираща фюжън пептид със последователност от (А) бета-субединицата на бозайническия гонадотропин в четящата матрица, следвана от (Б)трансмембранен и цитоплазмен домен от ген кодиращ вирусен гликопептид на везикулозния стоматит, когато нуклеотидната последователност е включена във вирус и вирусът е използван да инфектира клетка гостоприемник, фюжън пептидът се експресира и закотвя на гостоприемническата клетъчна мембрана.
2. Нуклеотидната последователност (I) съгласно претенция 1, която включва още нуклеотидната последователност (II), кодиращ алфа-субединица от овчия лутеинизиращ хормон, поставена в вирус, като алфа-субединица е в състояние да се свързва с фюжън пептида за сътрудничество и да се изразява заедно с фъжън пептида в една и съща клетка домакин.
3.Рекомбинантният ваксинен вирус състоящ се от нуклеотидна последователност като в твърдение 1. вмъкната в регион на ваксинния вирусен геном не е съществен за преживяването на вируса в гостоприемническата клетка.
4. Рекомбинантна вирусна ваксина, състояща се от нуклеотидната последователност според твърдение 2, поставена в района на вирусния геном на ваксина не са от съществено значение за оцеляването на вируса на ваксина в клетката-гостоприемник.
5. ваксина за контрол на раждаемостта, което включва поне един рекомбинантен вирус според твърдение 3.

6. ваксина за контрол на раждаемостта, което включва поне един рекомбинантен вирус според твърдение 4.

7. Метод за контролиране на фертилитета при бозайник, който включва администриране действителният размер на ваксина за контрол на раждаемостта, според твърдение 5.

8. Метод за контролиране на фертилитета при бозайник, който включва администриране действителният размер на ваксина за контрол на раждаемостта, според твърдение 6.
 Описание:
Населението се разраства с бързи темпове в много икономически развиващите се страни и продължава да има нужда от алтернативен метод за регулиране на плодородието. Ние предложихме няколко години назад ваксина за контрол на раждаемостта, което предизвиква образуването на антитела срещу човешкия хормон на бременността, човешки хорионгонадотропин (ЧХГ). Тези изобретения са описани в патенти, издадени в Индия, САЩ и няколко други страни. (Ref. ЕП 204566, JP 62286928, CA 1239346, САЩ Пат номер 4780312, КН 8603854). Ние описваме сега друго изобретение, което генерира антитяло отговор на дълъг период от време срещу ЧХГ след един или ограничен брой инжекции.
Като има предвид, че възможността за контролиране на плодородието чрез повишаване на антителата срещу ЧХГ е известно от нашите предишни проучвания, както и тези на другите, ваксини, използвани по-рано са били конюгати на две или повече пептиди като естествен бета ЧХГ пептид от 145 аминокиселини, свързани с тетаничен токсоид или други превозвачи. В друга модалност, бета ЧХГ пептид се свързва с алфа OLH и свързани с превозвачи (Talwar и др 1988; САЩ Пат 4780312). Търсенето тези ваксини пречистване и подготовка на съставните протеини от естествени източници. Цената на някои от тях в момента е много висока, което ще бъде рестриктивно за голямото им мащабно използване в програми за семейно планиране на икономически развиващите се страни. Освен това, тези ваксини изискват три инжекции за първична имунизация, последвана от 1/4 като бустер. Основно предимство на настоящия въплъщение е възможността за получаване на задоволителен и устойчив антитяло отговор с една основна инжекция и най-много един бустер. Друга интересна особеност е ниската цена, на която тази ваксина може да се подготвят и за широкомащабно използване.
 Ваксинният вирус е добре известен като универсален инструмент за молекулярни биолози. В New Scientist от 3 декември 1988 г. (Anon, стр.38) статия се отнася за нова ваксина за чума по говедата - вирус при говедата в много държави. Ваксината е генетично модифицирана версия на вируса при което изследователите, трансформират два гена, кодиращи покритивката на вируса за чума по говедата в вируса на ваксината.
 В Tibtech статия от януари 1990 г., Миньор и сътр. (стр. 20-25), обсъжда ваксина вирус като универсален инструмент за молекулярни биолози и предполага, че "вируса на ваксина система е обещаващ начин за производство на значителни количества на правилно обработени протеини и промяна еукариотните протеини в клетките на бозайниците ".
 САЩ Пат. 4603112 (изобретатели: Д. PAOLETTI и др; Издадена: Jul. 29, 1986) разкрива методи за модифициране на генома на вируса на ваксина за производство на рекомбинантен вирус ваксина, включваща ДНК, несрещащ се естествено в вирус ваксина. Препратката включва препратка към хетероложната ДНК, кодираща протеин, който може да бъде антиген, тя не изглежда да прави предложение, че тази технология е път към ваксини за контрол на раждаемостта, които също са двойни ваксини , които могат да повишават антителата и срещу протеини или пептиди несвързани с бозайническата репродуктивна система.
 PCT Публикация № WO88/06626 (изобретатели: Б.Р. Блум и др; подаден: 29 февруари, 1988 г.) се отнася до използването на рекомбинантен микобактерии, като превозно средство, способно да изрази чужда ДНК. Той също така показва, че като микобактерият може да се използва като антиплодовитост ваксина на превозното средство. Въпреки това, изглежда, че няма претенции за използването на микобактерии за контрол на плодородието и насочва читателите от използването на ваксинация в тази област, посочи предполагаемите недостатъци на страници 4 и 5.
Ето защо изглежда, че необходимостта да се осигури безопасно, проста и ефективна ваксина за контрол на раждаемостта,на по-ниска цена, което също може, ако е необходимо, да действа като ваксина срещу репродуктивна система и свързаните с тях заболявания като инфекции от бактерии и вируси. Докато някои от препратките предполагат, че употребата на ваксина като биотехнологично инструмент, други справки, особено Блум и др изглежда да разубеди сериозно внимание към ваксината. С оглед на разходите, които участват в този тип изследвания следователно не може да се каже, че има ясни знаци за научни разработки в тази област, сочещи към използването на ваксинация и ваксини за контрол на раждаемостта.
Следователно настоящото изобретение осигурява нуклеотидна последователност, състояща се от първата серия кодиране за бозайнически репродуктивен хормон пептид или активни фрагменти от него в четящата рамка привеждане в съответствие с ген или фрагмент на ген, кодиращ протеин или пептид несвързан с бозайническата репродуктивната система и една втора серия кодиране на част от вирусния геном на ваксина.
Изобретението осигурява нуклеотидната последователност, състоящ се от първата серия кодиране (а) бета субединицата на хорионгонадотропин (б) алфа-субединица на лутеинизиращия хормон или (в) или бета субединицата на хорионгонадотропин или субединица алфа лутеинизиращия хормон в четящата рамка приведена в съответствие с ген или фрагмент на ген, кодиращ протеин или пептид несвързан с бозайническата репродуктивната система и една втора серия кодиране като част от вирусния геном на ваксина.
 Изобретението осигурява нуклеотидна последователност, състояща се от първата серия кодиране за: (а) бета субединицата на човешки хорион гонадотропин, (б) алфа-субединица от овчи лутеинизиращ хормон или (в) или бета субединицата на човешки хорион гонадотропин или субединица алфа на овчи лутеинизиращ хормон в четящата рамка приведена в съответствие с ген или ген фрагмент кодиращ хепатит В повърхностен протеин, и една втора серия кодираща поне част от вирусния геном на ваксина.
 Горните нуклеотидните последователности са за предпочитане като добавка в несъществените части от вирусния геном на ваксина, за да се даде рекомбинантна вирусна ваксина.
Ваксината може да се състои на гените на бета субединицата на ЧХГ разтопен на ДНК ниво с ген фрагмент за кодиране за транс-мембранен протеин или пептид. Предпочитаният транс-мембранен пептид се състои от 49 аминокиселини. А ваксина спътник може да се състои от физическа смес от ваксина-бета ЧХГ (например vSS2) и ваксина-алфа овчи лутеинизиращия хормон (OLH), напр. (VSL5).
Според настоящото изобретение се предоставя ваксина за контрол на раждаемостта, състоящ се от рекомбинантен бета субединицата на човешки хорион гонадотропин, рекомбинантен овчи алфа лутеинизиращ хормон или смес от тях.
 Предпочитаното представяне се състои от рекомбинантен вирус, например vSS2, в който е поставен в генът за бета субединицата на човешки хориогонадотропин, примесен с ген, кодиращ транс-мембранен пептид на ваксинен вирус.
Друго предпочитано въплъщение се състои от рекомбинантен вирус като vSL5, в който е поставен в генът за алфа-субединица от OLH вирус ваксина.
 Друго предпочитано въплъщение се състои от рекомбинантен вирус, в която първата нуклеотидната последователност се състои от бета единица човешки хорионгонадотропин в четящата рамка приведена в съответствие с гена, отговарящ за Близкия протеин на хепатит В повърхностен протеин. Други протеини от други организми, особено патогени, или дори синтетични последователности могат да се кодират на мястото на протеини от хепатит Б.
 КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТЕЖИ
В рисунки, които илюстрират въплъщения на изобретението;
ФИГ. 1 показва стратегията за изграждане на закотвени бета ЧХГ;
ФИГ. 2 показва стратегия за поставяне на алфа OLH ген в ваксина вирус и
ФИГ. 3 показва анти ЧХГ отговор по отношение на антиген-свързващия капацитет. Фигура показва типична антитяло-отговор в четири плъха, получавали еднократна инжекция от vSS2 рекомбинантна ваксина в доза от 10 PFU (плака формиращи единици). Всяко животно отговори с антитела в обращение, измерими в края на четири седмици. Титри варират 100-900 нг / мл и са отчетливо над праговата стойност от 20 нг / мл счита за защита срещу бременност. Титри са повишени в продължение на 12 седмици на наблюдение.
 Фигури. 4а 4h Развитие показват на ЧХГ антитела в 8 капака маймуни, инжектирани с vSS2 рекомбинантна ваксина.
ФИГ. 5 показва стратегията за изграждане на BHCG HBsAg. Крайният плазмид, pSS4 се показва заедно с последователности кръстовището между BHCG и HBsAg.
ФИГ. 6 показва южната петно ​​на pSS4. Ген Ник преведени S е била използвана като сондата и се измива с висока строгост.
ФИГ. 7 показва subcloning на хепатит B геном в pUC плазмиди.
ФИГ. 8 дава резултатите от теста за BHCG и HBsAg. На оста X-три паралелни пречистени рекомбинанти на вируса vSS4 (1,2 и 3) заедно с vSS2, вътрешния контрол и Абът положителни и отрицателни контроли.
ФИГ. 9 показва развитието на ЧХГ антитела в 7 плъхове, инжектирани с vSS4 рекомбинантна ваксина.
 ПРИМЕР 1
Синтез и полезността на рекомбинантен Anti-HCG ваксина
Изграждането стратегия на vSS2: Вирусът, съдържащ закотвен бета ЧХГ е направено от в рамка сливане на транс-мембранни и цитоплазмената области на гена, отговарящ за везикулозен стоматит гликопротеин вирус (VSVg) към края на 3 "на бета ЧХГ сДНК (фиг. 1). Усвоява с Alu I и Xho VSVg ген I, за да освободи 249 базисни пункта последователност котва мембрана. Елуират от акриламид гел Този фрагмент, klenow пълни и лигира на СМА, нарязани вектор PSS I, последният е изготвен от процедурата, описана от нас по-рано (Chakrabartit и др 1989). Ориентация на котвата последователност с позоваване на бета ЧХГ беше проверен от подходящи разлагане ограничение ензими. Това е бил използван за transfect CV-1 клетки, предварително заразени с дивия тип вирус и рекомбинанти се качват чрез визуална скрининг за сини плаки от техниката, описана на друго място.
 Състав за бета ЧХГ
Изразяване на бета ЧХГ е бил открит в за пелети от vSS2 заразените клетки от конкурентен радио метод, с помощта на моноклонални антитела от мишка, повдигнати срещу бета ЧХГ. Клетъчната локализация на ЧХГ се определя чрез имунофлуоресценция използва техниката анти бета ЧХГ Моав, последвано от заешки анти мишка конюгиран с FITC.
Имуногенни свойства: Едно интрадермално инжектиране на 10 8 PFU vSS2 предизвика образуването на антитела при плъхове, които реагираха с ЧХГ (фиг. 3) и предотвратява ефективно свързване на чХГ за рецепторите на прицелна тъкан. Антитела се открива в рамките на четири седмици. Титри се запазиха без спад в продължение на период от няколко месеца.
Титрите на антителата при маймуни, имунизирани с рекомбинантен анти ЧХГ ваксина (vSS2):
Bonnet маймуни (Mecacca Radiata) интрадермално с 10 8 PFU на рекомбинантна ваксина са имунизирани. Две имунизации са извършени на 3 месечен интервал от време (ден 0-95). Четири месеца по-късно (ден 226), бустер инжекция от 100 мкг на бета ЧХГ, адсорбирани върху стипца интрамускулно. Анти ЧХГ антитела са измерени (квадратура. Квадратура) по радио метод (виж Ом Сингх и др). Те се изразяват по ординатата на логаритмична скала. Титрите на антителата са измерими след първата имунизация с рекомбинантна ваксина. Техните титри след два първична и бустер инжекция се увеличи до много високи нива, вариращи от 3200 до 14 000 ПГ на ЧХГ способност за свързване на милилитър. Тези антитела имат висок афинитет (ка = 10 -11 LM). Антителата са компетентни да се предотврати свързването на чХГ за рецепторите прицелна тъкан, както е определено от конкурентни тестове радио рецептори (+ - +).
Компетентността на антителата при неутрализиране на биоефикасността на ЧХГ показва ефективността на имунизиране с такива ваксини, за да се намесим в събития, подкрепени от ЧХГ, като например създаване и поддържане на ранна бременност.
 . 4 дава данни в осем маймуни, за да се демонстрира последователност на явлението. Тези експерименти показват имуногенността на тези продукти не само при гризачи, но също така и в примати (и в по-широк, хора).
Към днешна дата, най-добри резултати при маймуни и плъхове са били получени с 10 8 PFU. Работния диапазон се движи от около 10 9 надолу на около 10 4 PFU, за предпочитане на поръчката от 10 7 10 8 PFU. Интересното е, че доза не се появи на работа в този случай въз основа на телесното тегло и това може да бъде свързано с използването на жива ваксина. Затихване от passaging може да бъде полезна, за да се избегнат възможни странични ефекти.
ПРИМЕР 2
Синтез и полезността на ваксина за борба с OLH
Изграждане на vSL5: OLH сДНК алфа е бил отрязан от ограничението ензим Bgl II е описано по-рано вектор (Lall et 1988). Този фрагмент е klenow пълни, лигира 8-Mer linkers РИ Еко и клонирани в уникално място Eco RI на ваксина вектор pSC45 (фиг. 2). Крайният плазмид, pSL5 се характеризира в подробности по отношение на правилната ориентация на алфа ген OLH от множество разлагане ограничение ензими и Южна хибридизация. Този плазмид впоследствие е използван в ДНК трансфекция за изграждане на рекомбинантен вирус vSL5, както е описано по-рано.
Състав за алфа OLH
Средата на клетките, заразени с рекомбинантен вирус vSL5 анализ за наличие на алфа OLH от конкурентна радио метод, използващи анти алфа OLH антитела, повдигнати в маймуни. Израз на алфа OLH е количествено с помощта на стандартен пептид субединица. Наличието на алфа OLH могат да бъдат засечени в рамките на три часа на инфекция и е установено, че 280 ng/ml/310 6 клетки в рамките на 24 часа.
ПРИМЕР 3
Производство на смесените рекомбинантни ваксини
Биологична активност: Алфа OLH субединица свързва с бета ЧХГ да образуват хетероатоми-димер. Способността на този хетероатоми-димер, за да се стимулира стероидогенезата в Лайдиговите система клетъчна е добре установена (Talwar и др., 1988). За да покаже, че рекомбинантен алфа OLH-бета ЧХГ хетероатоми-димер запазва своята биологична активност, ко-инфекция на вируси vSS1 и vSL5 беше направено в CV1 клетки и супернатанта, които се събират 24 часа след заразяване е бил използван в Лайдиговите клетки био-анализ. Стероидогенезата предизвикани от ваксина изрази алфа OLH-бета ЧХГ хетероатоми-димер е по-голяма от родния ЧХГ димер посочване на точна и пълна дължина израз на двете пептиди.
Подобна е и малко био-ефективно по-добре имунната реакция към показаното от конструкт vSS2 сам може да се генерира чрез използване на смес от конструкции vSS2 и vSL5. Известно е от други проучвания, че антителата, генерирани от heterospecies димер на бета ЧХГ и алфа OLH имат около 25% по-добра био-ефикасност като функция на техните имунологични титри, в сравнение с тези, генерирани на бета ЧХГ сам.